Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng khu vực xuân hòa

ngày càng được hoàn thiện và hợp lý hóa, lĩnh vực ứng dụng chế phẩm enzyme ngày càng được mở rộng. Sản lượng hàng năm tới vài trăm ngàn tấn chế phẩm và được sử dụng trong hơn 30 ngành khác nhau: Công nghiệp thực phẩm, thuộc da, dệt, phim ảnh, y học (chữa bệnh và phân tích hóa sinh ), bảo vệ môi trường…Ở nước ta, nghành công nghiệp enzyme đã được hình thành và hy vọng rằng trong tương lai không xa sẽ được phát triển cùng với trào lưu chung của công nghiệp và hiện đại hóa đất nước. Cellulose là thành phần chủ yếu tạo nên bộ khung xương tế bào thực vật. Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây xanh tổng hợp trên trái đất trong đó có 30% là thành tế bào thực vật, thành phần chủ yếu của thành là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một lượng chất thải khổng lồ (chất thải công nghiệp, chất thải sinh hoạt, chất thải thực vật như lá, cành…). Thành phần chủ yếu của các loại chất thải này là cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật đất đóng vai trò rất quan trọng đặc biệt là các chủng vi sinh vật có hệ enzyme cellulase có tác dụng phân giải cellulose. Từ những lí do trên cùng với việc tận dụng khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn trong đất tôi đã lựa chọn và nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc”. 2. Mục tiêu 2.1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa. 2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase mạnh nhất. 2 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng khu vực Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc. 3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy : HSKS, HSCC, sắc tố tan, cuống sinh bào tử. 3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa: khả năng chịu muối, khả năng sử dụng các nguồn cacbon, khả năng sinh enzyme ngoại bào. 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn được chọn. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Ảnh hưởng của nguồn nitơ 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên của VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Tạo cơ sở cho các phương thức canh tác (cày sới, cải tạo đất, bón phân, luân canh, xen canh…) theo hướng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng cường phân giải các hợp chất hữu cơ làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng. Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng dụng các chủng này vào đời sống (chăn nuôi, bảo vệ môi trường…) Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy góp phần tìm ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển và ứng dụng trong xử lí rác thải. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số vi sinh vật [20]. Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi lớn về số lượng xạ khuẩn trong đất, số lượng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lượng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật…Đất giàu dinh dưỡng hữu cơ, khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo dinh dưỡng. Trong 1g đất canh tác có thể phân lập được 5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng xa mạc khô nóng, nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6.8 – 7,5. Đồng thời số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện như thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử). Hệ thống sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1,0µm đến 2,0 – 3,0µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [4]. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước của bào tử. Trường hợp không có HSKS khuẩn lạc thường có dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ khuẩn). Một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của những vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng. Khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng cơ chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty phát triển yếu đi. Cứ như thế tạo thành các vòng tròn đồng tâm [5]. Khuẩn lạc có ba lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. 5 * Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử gọi là HSKS (khuẩn ty khí sinh – aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là HSCC (khuẩn ty cơ chất – substrate mycelyum) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu sắc khác với màu sắc của HSKS. Đây cũng là đặc điểm phân loại xạ khuẩn quan trọng. Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trường khi cấy chuyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi trường hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1mm đến 2- 3mm [3]. 1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng sợi, dày 10 – 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 – 120A0, khi già có thể đạt tới 150 – 200A0, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50 A0. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – acetylglucozamin 6 liên kết với N – acetylmuramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozid. Khi sử lý bằng lyzozyme, các liên kết 1,4 – β glucozid bị cắt đứt, thành tế bào bị phá hủy tạo thành thể sinh chất ( protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi sử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hòa tan lipid khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [9]. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào được chia thành 4 nhóm chính [9], [4]: Nhóm I : Thành tế bào có L-Axit diaminopimelic (L- ADP) và glixin Nhóm II : Thành tế bào có meso- ADP và glixin Nhóm III : Thành tế bào có meso- ADP Nhóm IV : Thành tế bào có meso- ADP, đường arbinose, galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharid bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong AND, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỉ lệ này là 25 – 45% [6]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thề còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có 7