Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc m4v có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi

Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi. SVTH: Nguyễn Thị Dung 11 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật 1.1.1. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%) [27]. Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn công [27]. Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Ao và xếp xen kẽ với vùng vô định hình [27]. SVTH: Nguyễn Thị Dung 12 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (β – glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro[27]. Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1→4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27]. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ SVTH: Nguyễn Thị Dung 13 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [24]. 1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ. Cùng với cellulose, hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1) [27]. SVTH: Nguyễn Thị Dung 14 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến Nguồn lignocellulose Cellulose Hemicellulose Lignin (%) (%) (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hoá học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12 25-40 25-50 10-30 33.4 30 18.9 Các loại cỏ (trị số trung bình cho các loại) Bã thô SVTH: Nguyễn Thị Dung 15 K35B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase 1.2.1. Hệ thống cellulase Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase và β-glucosidase.  Endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4).  Exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91).  β – glucosidase hoặc β – glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [28]. 1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase SVTH: Nguyễn Thị Dung 16 K35B – SP Sinh