Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

Hình 3.17. Khả năng tạo màng BC ở thời gian 2 ngày và 5 ngày Hình 3.18. Khả năng tạo màng BC ở thời gian 250C và 300C Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hì nh thành màng BC Hình 3.20. Khả năng tạo màng BC ở pH: 5 và pH: 3 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chủng A.xylinum BHN2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân nhánh. Màng BC do chủng A.xylinum BHN2 tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ. Trên thế giới việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC đã đạt được nhiều thành tựu to lớn trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy, công nghệ môi trường, công nghệ mỹ phẩm, trong y học,… Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sản xuất màng BC mới được quan tâm trong thời gian gần đây và mới thu được những kết quả bước đầu (dùng màng BC đắp lên vết thương hở, dùng màng BC đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ). Nhằm tìm kiếm nguồn nguyên liệu có bản chất polyme sinh học để tạo cơ sở cho sản xuất màng trị bỏng và nhiều ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ” 1 2. Mục tiêu Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2. 3. Nội dung 3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2 3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường nuôi cấy khác nhau 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 3.4. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho chủng A.xylinum BHN2 để tạo màng BC có chất lượng tốt trong thời gian ngắn. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo được màng BC bước đầu ứng dụng trong lĩnh vực trị bỏng ở thỏ 5. Điểm mới Sự hì nh thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tốt nhất trong môi trường dinh dưỡng gồm: nước dừa 1000ml, glucose: 20g/l, (NH4)2SO4: 3g/l, KH2PO4: 2g/l, MgSO4. 7H2O: 3g/l. Lên men tĩnh trong 5 ngày ở điều kiện nuôi cấy là t0: 300C, pH: 5 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum trong sinh giới 1.1.1. Vị trí phân loại của chủng A.xylinum Tên gọi: A.xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990. Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xưa tới nay. Từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng. Tuy nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn nhiều tranh cãi [7]. Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans [24]. Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” ông đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [19]. Năm 1974, “Bergey’s manual of determinative bacteriology”. A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc [19]. Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí khác nhau. Theo “Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey’s manual of systematic bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconobacter. Vi khuẩn A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter. Các nghiên cứu tiếp nhằm cải thiện hơn quá trình lên men và từng bước phân loại Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng thành các nhóm khác 3 nhau đồng thời nghiên cứu đặc tính sinh học đặc trưng cũng như ứng dụng của từng nhóm. 1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum Đặc điểm hình thái - tế bào học Chủng A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic cao vượt giới hạn cho phép, nó sẽ gây ức chế hoạt động của vi khuẩn [4], [20], [21]. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, chủng A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Chủng A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại ở trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn với cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14], [21], [26]. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá Đặc điểm sinh lý Chủng A.xylinum phát triển pH: 4 – 6, nhiệt độ 25 - 350C, nhiệt độ, pH tối ưu tuỳ thuộc chủng. Khi tăng nhiệt độ lên 370C thì vi khuẩn không sinh cellulose và tế bào sẽ suy thoái dù được nuôi cấy trong môi trường tối ưu. Chủng A.xylinum chịu được pH thấp, bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy để giảm sự nhiễm khuẩn lạ [23]. 4 Đặc điểm sinh hoá Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [22]…Theo quan điểm này chủng A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong một chi được trình bày bảng 1.1: Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng A.xylinum STT 1 2 3 4 5 6 7 Đặc điểm Hiện tƣợng Chuyển hoá môi trường chứa Oxy hoá ethanol thành Bromphenol Blue 0,04% từ màu acid acetic xanh sang màu vàng Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí Sinh trưởng trên môi Sinh khối không phát triển trường Hoyer Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch thành dihydroxyaceton sau lên men Vòng sáng xuất hiện xung quanh Chuyển hoá glucose khuẩn lạc trên môi trường chứa thành acid CaCO3 Kiểm tra khả năng sinh Không hình thành sắc tố nâu sắc tố nâu Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu hợp cellulose lam Kết quả + + _ + + _ + 1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose và màng BC 1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose Cellulose là một polisaccarit có phân tử lượng: 8.105 – 22,68.105 đvC. Có công thức chung của tinh bột (C6H10O5)n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000 – 14000. Mỗi phân tử cellulose gồm những đường đa được cấu tạo từ các liên kết glucose. Các phân tử glucose nối với nhau ở vị trí β-1,4 5