Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng gluconacetobater BHN2

Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Gluconacetobacter như một loài phụ của A. aceti [14]. Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất. Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [15]. Nguyễn Thị An 3 K35C Khoa Sinh- KTNN Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH : 4-6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [10]. Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose [10]. 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC. * Cấu trúc của màng Bacterial cellulose: Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Nguyễn Thị An 4 K35C Khoa Sinh- KTNN Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Sợi cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật Hình 1.2. Cấu trúc cellulose Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [16]. Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn. Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn Gluconacetobacter được nghiên cứu đầu tiên bởi Brown. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose [16]. Nguyễn Thị An 5 K35C Khoa Sinh- KTNN Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của Gluconacetobacter. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng A. xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Gluconacetobacter là glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng Gluconacetobacter [9], [5]. 1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất [8], [6]. 1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC [3]. Nguyễn Thị An 6 K35C Khoa Sinh- KTNN Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter. Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao [7]. 1.3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn. Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng. Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Đối với loài Gluconacetobacter, trong quá trình lên men, phần lớn các tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dịch thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất. Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời gian lên men [8]. 1.3.2. Độ thông khí Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ Nguyễn Thị An 7 K35C Khoa Sinh- KTNN Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng [5]. Wan phát hiện áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC [17]. 1.3.3. Nhiệt độ 0 Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter từ 25-35 C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men giảm [17]. 1.3.4. Độ pH Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [19]. 1.4. Ứng dụng của màng BC 1.4.1. Ứng dụng của BC Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các Nguyễn Thị An 8 K35C Khoa Sinh- KTNN