Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia UV

Khóa luận tốt nghiệp Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở 1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [1]. Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1]. 1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ ( SO42-, Cl- …) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các Nguyễn Ngọc Mai 11 K35C Khoa Sinh-KTNN Khóa luận tốt nghiệp Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù đắt hơn). Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [1]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [1]. 1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 2-10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt nhất ở 0,6% . Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3-3,5% . Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7-10% V. Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid acetic và muối acetate [1], [23]. Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hoá các rượu khác thành các acid tương ứng. 1.2. Lƣợc sử nghiên cứu về vi khuẩn A. xylinum trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu A. xylinum trên thế giới Hiện nay, vi khuẩn A. xylinum và ứng dụng của nó đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tập trung theo hai hướng cơ bản: Nguyễn Ngọc Mai 12 K35C Khoa Sinh-KTNN Khóa luận tốt nghiệp  Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 Hƣớng thứ nhất: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính sinh học của A. xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh giới. Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck, Frateur [20]. Trên cơ sở nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa các tác giả xác định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A. xylinum. Các nghiên cứu của một số nhà khoa học Nhật Bản như Kumiko Nanda và cs, P. M. Kutima; T.T. Kadere và cs [25]. Các tác giả phân lập tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính sinh học của A. xylinum, và một số chủng vi khuẩn acetic khác phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống của Nhật như Mnazi, Komesu, Kurosu.  Hƣớng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng dụng của BC vi khuẩn A. xylinum. Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng A.xylinum; ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp cellulose. Mở đầu là S. Hestrin; M. Scharmn và cs [22], [27], [26], sau là một loạt các nghiên cứu tương tự, [19], [21], [23]. Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A. xylinum. Mở đầu là nghiên cứu của R.M. Brown và cs, K.Zaar [18]. Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cenllulose, các hệ enzyme tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A. xylinum mới dần được sáng tỏ [27]. Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt là màng trị bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết quả tốt như Wan và Millon đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ A. xylinum dùng trị bỏng [28]. Về sau có nhiều tác giả khác cũng nghiên cứu về hướng này. Nguyễn Ngọc Mai 13 K35C Khoa Sinh-KTNN Khóa luận tốt nghiệp Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 1.2.2. Tình hình nghiên cứu A. xylinum ở Việt Nam Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn. Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A. xylinum ngày càng được quan tâm . Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến A. xylinum sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [9]; sản xuất thạch dừa [7]. Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ [29]. Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên Nguyễn Ngọc Mai 14 K35C Khoa Sinh-KTNN Khóa luận tốt nghiệp Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [30]. Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan, nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A. xylinum và hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước, Bacterial cellulose , Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10]. Và tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công [14]. 1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau. Sợi cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật Hình 1.2. Cấu trúc cellulose Nguyễn Ngọc Mai 15 K35C Khoa Sinh-KTNN Khóa luận tốt nghiệp Ðại học Sư phạm Hà Nội 2 Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng. 1.3.2. Cơ chế tổng hợp màng BC Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [16]. Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose. Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose – 6 phosphat thành glucose – 1 phosphat. Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP): Xúc tác tổng hợp UDP – Glucose. Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP – glucose. Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình dưới đây Nguyễn Ngọc Mai 16 K35C Khoa Sinh-KTNN