Nghiên cứu tác dụng của màng BC từ vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum 1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chính chính thức theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990. Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xưa tới nay. Ngay từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng. Tuy nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn còn nhiều tranh cãi. Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans. Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” 19 ông đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Tuy nhiên, đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”  22 A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc. Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí khác nhau. Như theo “Applied and Envitromene microbiology”  25 và “Bergey’s manual of determinative bacteriology”  28 thì họ Acetobacteracae gồm hai chi vi khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconbacter. Vi khuẩn A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter. Tới nay, đã tồn tạo nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng. Vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo. 4 1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum  Đặc điểm hình thái, tế bào học Đặc điểm A.xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Các tế bào được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Màng này bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc nhuộm iot và dung dịch acid sulfuric 60%. Chúng tích lũy khoảng 4,5% acid acetic, khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn. A.xylinum thường sống chung với nấm chè trong một loại nước giải khát dân gian làm từ nước chè loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, Người Trung Quốc gọi là “Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nấm chè”, người Pháp gọi là “Chamignon De Longue Vie – nấm trường sinh”, người Nhật gọi chúng là “Kombuchan” 31 . Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất  22 .  Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường 16 . Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose. Màng cellulose là tập hợp những bó sợi cellulose liên kết với nhau, chúng được hình thành từ tập hợp các sợi microfiril 30 . Nó bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn có chức năng bảo vệ chúng khỏi tác động bên ngoài môi trường. Vì vậy, chúng có thể tồn tại ở những vùng nước thải. Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong 5 môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh như: sự phân nhánh của sợi cellulose nhiều hơn, đường kính bó sợi lớn hơn (0,05 - 0,1µm) 13 .  Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Theo Bergey, pH tối thích cho vi khuẩn A.xylinum là 5,4 - 6,2; nhiệt độ tối thích là 25 - 30oC. Một số nghiên cứu chỉ ra A.xylinum có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 12 - 35oC. pH từ 3-8 trong đó pH tối thích là 6. Năm 1947, Hestrin và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A.xylinum tạo màng BC bao gồm 2% đường glucose, 0,5% pepton, 0,5% cao men, 0,27% NaHPO4, 0,115% citric acid monohydrate, pH thích hợp là 4,5. Hiện nay, vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn A.xylinum sinh trưởng và tạo màng. Dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Beijerinck (1898) phân chia các loài vi khuẩn A.xylinum thành 2 nhóm: Nhóm 1: Có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2và H2O Sử dụng muối ammonium làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi trường Hoyer). Dạng điển hình là vi khuẩn A.aceti. Không sử dụng muối ammonium là nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo thành lớp màng nhày chứa cellulose, điển hình là vi khuẩn A.xylinum. Trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không tạo màng nhày, điển hình là A.zancens, A.pasteurianu, A.kneizigianus. Nhóm 2: Không có khả năng oxy hóa acid acetic Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucose: sắc tố nâu đen đến nhạt (A.melagenus), sắc tố hồng (A.zancens). Không tạo sắc tố: nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 35oC (A.suboxydans), nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 21oC (A.oxydans). Theo quan điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomanadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. 6 Đến năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O, hoạt tính catalase, khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer. Theo quan điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomanadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A. xylinum theo Frateur  21 Đặc điểm STT Hiện tƣợng Kết quả Oxy hóa ethanol thành Chuyển hóa môi trường chứa 1 acid acetic Bromphenol Blue 0,04% từ màu + xanh sang màu vàng 2 3 4 Sinh trưởng trên môi Sinh khối không phát triển trường Hoyer Chuyển hóa glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau thành dihydroxyaceton Chuyển 5 Hiện tượng sủi bọt khí Hoạt tính catalase hóa thành acid lên men + - + glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa + CaCO3 6 7 Kiểm tra khả năng sinh Không hình thành sắc tố nâu sắc tố nâu Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam hợp cellulose - + 1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào 7 hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở 110oC trong 20 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,5 - 0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [6]. Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [6]. 1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl- …) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù đắt hơn). Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [6], [9]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân 8 tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [5], [7]. 1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 2 - 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - 1% tốt nhất ở 0,6%. Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10%V. Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid acetic và muối acetate [5], [7], [17], [20]. Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có kh ả năng oxy hoá các rượu khác thành các axit tương ứng. 1.2. Bỏng và đặc điểm của các nhóm thuốc trị bỏng 1.2.1. Bỏng và sinh bệnh học tổn thương bỏng 1.2.1.1. Bỏng Bỏng là tổn thương do tác dụng trực tiếp của các các yếu tố như sức nhiệt là loại thường gặp nhất: sức nhiệt khô (lửa, kim loại nóng chảy, tia lửa điện; sức nhiệt ướt (nước sôi, dầu mỡ, hơi nước); hóa chất (axit, bazơ); điện năng; bức xạ vật lý (tia hồng ngoại, tử ngoại, tia phóng xạ). Trong bỏng nhiệt, khi mô tế bào bị nóng đến 43 - 45oC, sự sống của tế bào bị đe doạ. Nếu nóng đến 46 - 47oC, lượng Adenozin Triphotphat (ATP) giảm 50%. Nếu nóng đến 50oC thì tổn thương còn có thể phục hồi, nóng từ 50 - 60oC thì các thành phần protein bị biến thoái, không thể phục hồi. Nếu nóng đến 60 - 70oC thì mô tế bào bị hoại tử ngay khi tác nhân nhiệt tiếp xúc. 1.2.1.2. Sinh bệnh học tổn thương bỏng Da là tổ chức che phủ toàn bộ cơ thể đồng thời có nhiều chức năng như: điều hòa nhiệt độ cơ thể, hàng rào bảo vệ cơ thể, là cơ quan xúc giác, bài tiết 9