Nghiên cứu thành phần các hợp chất steroid từ cây na rừng(kadsura cocci nea)

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực vừa phải...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.2.1. Chọn dung môi chiết. Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Đôi khi, để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp, người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỉ lệ nhất định để tạo ra một hệ thống dung môi mới. Tuy nhiên, những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được ở dạng sạch trước khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylnitrat và tributylphotphat. Những chất này có thể hòa lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa. Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat, [di-(2- etylhexyl) phtalat hoặc bis- 2- etylhexyl- phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Clorofooc, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…). Những tạp chất của clorofooc như: CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit Clohidiric (HCl) cũng có Lê Thị Hương 11 K31A- Khoa Hoá học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Bởi vì Clorofooc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi khô thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofooc. Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, clorofooc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng sẽ bị hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên, cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ: trechlonolide A thu được từ Trechonaetes laciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với methanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy 1- hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng. Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dung dịch nước của metanol. Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2cis- diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi Lê Thị Hương 12 K31A- Khoa Hoá học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo ra những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự thủy phân chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 300- 400C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2. Quá trình chiết. Hầu hết quá trình chiết được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước. - Chiết lôi cuốn theo hơi nước. Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật, bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi; dung môi có thể nóng hoặc lạnh. Trước kia, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh. Thông thường, quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết ba lần dung môi, cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Bởi vì khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như Lê Thị Hương 13 K31A- Khoa Hoá học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp tác nhân Dragendorff và tác nhân Mayer. Khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Trong trường hợp các lacton của sequitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì mà lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta co thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.3. Các phương pháp sắc kí [3,12]. Phương pháp sắc kí là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay, pha tĩnh được sử dụng phổ biến là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như : silicagel, YMC, ODS, Al2O3…), còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc kí lỏng) hay chất khí (sắc kí khí). Pha động được dùng trong sắc kí lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn, và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi kém phân cực hơn. Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: ete, dầu hỏa, xiclohexan, cacbon tetraclorua, xylen, toluen, benzen, clorofoc, metylenclorua, axeton, dioxan, etyl axetat, piridin, propanol, metanol, axit axetic. Lê Thị Hương 14 K31A- Khoa Hoá học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete, dầu hỏa đến nước. Tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí mà người ta chia ra thành các phương pháp sắc kí chủ yếu như sau: 1.3.1. Sắc kí cột Sắc kí cột là một phương pháp hiện đại, tinh vi để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, người ta có thể tách hầu hết các chất trong bất kì một hỗn hợp nào. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm: - Lựa chọn chất hấp phụ. - Lựa chọn dung môi giải li. - Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng. - Vận tốc giải li. Chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau), pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion....Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, do đó khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong một số trường hợp, khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC). Trong sắc kí cột, tỉ lệ giữa chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D) rất quan trọng, đồng thời nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc Lê Thị Hương 15 K31A- Khoa Hoá học Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp kí, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách (tức là tùy thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến 1/30. Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột rất quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, người ta thường phải tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách tinh thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, rồi dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó, dùng dung môi chạy cột để chạy qua cột đến khi cột trong suốt. - Cách 2: nhồi cột ướt. Theo cách này, chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách. Do đó yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy rối trong cột, làm giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gãy. Lê Thị Hương 16 K31A- Khoa Hoá học