Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ mật = ERIOCHLOA RAMOSA

Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2. Một số cây họ Poaceae 1.1.3. Bộ phận dùng Rễ, thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô. 1.1.4. Tác dụng dược lý Các tác giả Lê Công Văn, Đỗ Trung Đàm đ• nghiên cứu tác dụng hạ sốt của cây cỏ mật trên cơ thể động vật. Thí nghiệm trên Thỏ có cân nặng 2,2 - 2,5 kg, đực, cái đều dùng, gây sốt bằng men bia hỗn dịch 10%, tiêm dưới da với liều lượng 2ml/kg và theo dõi trong vòng 6 giờ. Cao cỏ mật được chiết bằng cồn ethanol, dùng với 0,5g/kg cơ thể vào lúc 1 giờ 30 phút sau khi tiêm men bia. Kết quả là cao cỏ mật có tác dụng hạ sốt vừa phải, kém tác dụng của analgin 200mg/kg, nhưng kéo dài và đến giờ thứ năm tác dụng vẫn còn tồn tại. 1.1.5. Công dụng Cỏ mật được dùng theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số vùng Sơn Tây và Nam Định để chữa cảm, sốt, cúm, sốt xuất huyết... 1.2. Tổng quan về các phương pháp phân lập các hợp chất 1.2.1. Phương pháp chiết Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ quay cực vừa phải…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. a. Chọn dung môi chiết Các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây thường có độ phân cực khác nhau. Đôi khi để tạo ra sự phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ dùng dung môi đơn thuần mà phối hợp tỉ lệ nhất định để tạo hệ dung môi mới. • Yêu cầu với dung môi dùng cho quá trình chiết: Nó phải hoà tan các chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, dễ bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác vì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết • Những dung môi hay được sử dụng: + Clorofom, metylenclorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, củ, quả…). + Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo, người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào. + Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol. Hoàng Thị Thanh Dung 11 K30- Khoa hóa học Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp + Đietyl ete hiếm khi được dùng trong các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng dễ chuyển thành peoxit dễ nổ. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30oơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơơ ơơơơơơơơơơơơơơơ - 40oC với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. b. Quá trình chiết Hầu hết các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: • Chiết ngâm. • Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. • Chiết sắc với dung môi nước. • Chiết lôi cuốn theo hơi nước. Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng r•i nhất trong các quá trình chiết mẫu thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi. Mẫu thực vật được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra. Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết mà lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình hợp lý nhằm đạt hiệu qua cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất hoà tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.2.2. Các phương pháp sắc ký [3] Phương pháp sắc ký là phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Sắc ký có pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay phổ biến sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như silicagel, YMC, ODS, Al2O3 …) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng), hay chất khí (sắc ký khí). Pha động dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi kém phân cực hơn. • Nguyên tắc của phương pháp: Phương pháp sắc ký dựa vào độ khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ hấp phụ của dung môi tăng dần từ ete dầu hoả đến nước. Tuỳ thuộc vào cách tiến hành sắc ký mà người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau: a. Sắc ký cột (CC) Hoàng Thị Thanh Dung 12 K30- Khoa hóa học Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Đây là phương pháp phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion … chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột bằng thuỷ tinh hay cột bằng kim loại inox nhưng phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số lý thuyết càng lớn do đó khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong một số trường hợp khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) khi đó người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình ( MPC) hoặc áp suất cao ( HPLC ). Trong sắc ký cột tỉ lệ giữa chiều cao cột ( L) so với đường kính cột (D) rất quan trọng đồng thời nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách tức là phụ thuộc vào hỗn hợp cụ thể. Trong sắc ký tỉ lệ giữa qu•ng đường đi của chất cần tách so với qu•ng đường đi được của dung môi gọi là Rf. Với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Trong sắc cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng, tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì người ta thường phải tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột. Nếu tách tinh thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: • Nhồi cột khô • Nhồi cột ướt b. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc ký cột người ta còn dùng sắc ký lớp mỏng để điều chế, thu chất trực tiếp. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng axit H2SO4 10%. 1.3. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ người ta sử dụng phương pháp điểm nóng chảy và phương pháp phổ nhưng quan trọng nhất là dựa vào các phương pháp phổ. Tùy thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà người ta sử dụng những phương pháp phổ khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường Hoàng Thị Thanh Dung 13 K30- Khoa hóa học Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp hợp để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như độ dịch chuyển hoá hoá học kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh… 1.3.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) Phổ hồng ngoại được xác định dựa vào sự khác nhau về dao dộng của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia tử ngoại. Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Chính vì vậy, dựa vào kết quả phổ hồng ngoại người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng. Ví dụ: Dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl là 3300 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020-1100 cm-1, N - H (3400-3500 cm-1) … Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp. 1.3.2. Phổ khối lượng (Mass Spectrocopy) Phổ khối lượng (phổ MS) được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. • Nguyên tắc của phương pháp là: Dựa vào sự phân nhánh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng: a. Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrocopy) Phổ EI-MS dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 ev. b. Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectrocopy) Phổ ESI gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có năng lượng thấp dễ bị phá vỡ. c. Phổ FAB ( Fast Atom Bombardment Mass Spectrocopy) Nguyên tử nhanh với sự bắn phá nhanh ở năng lượng thấp do đó phổ cũng dễ thu được pic ion phân tử. d. Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrocopy) Phổ này cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Kết quả khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức của hợp chất hữu cơ. Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng các hợp chất. Hoàng Thị Thanh Dung 14 K30- Khoa hóa học Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonanc Spectrocopy, NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR 1 chiều và 2 chiều các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. • Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR: Là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C ) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). a. Phổ 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hoá học ( ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất. b. Phổ 13C-NMR [4] Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở 1 từ trường khác nhau và cho 1 tín hiệu vạch phổ khác nhau. Những pic có cường độ nhỏ tương ứng với nguyên tử cacbon không đính với hiđro còn pic có cường độ lớn thì ứng với thì ứng với nguyên tử cacbon đính với một hay nhiều nguyên tử hiđro. Thang đo cho Phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0 ppm đến 240 ppm ). c. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các C khác nhau. Trên các phổ DEPT tín hiệu của C bậc 4 biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về 1 phía và của CH2 về 1 phía trên phổ DEPT 135. Còn trên phổ DEPT 90 thì chỉ xuất hiệu phổ của các CH. d. Phổ 2D-NMR Đây là kỹ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian 2 chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: • Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) Hoàng Thị Thanh Dung 15 K30- Khoa hóa học Trường đại học sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Các tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ các tương tác trên phổ này. Trên phổ 1 trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. • Phổ 1H-1H COSY(HOMCOSY) 1H-1H Chemical Shift Corrolation Spectroscopy: Phổ này biểu diễn các tương tác H-H chủ yếu của các proton đính với C liền kề nhau. Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. • Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Do đó dựa vào việc phân tích phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. • Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử. Chương 2: Đối tượng và Các phương pháp nghiên cứu 2.1 Mẫu thực vật Cây cỏ mật (Eriochloa ramosa) được thu hái tại Đông Anh, Hà Nội vào tháng 9 năm 2006. Mẫu cây được ông Ngô Văn Trại giám định. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Dược liệu Bộ Y Tế. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 ( Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử Hoàng Thị Thanh Dung 16 K30- Khoa hóa học