Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin c trong một số loại rau bằng phương pháp von ampe

SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIT.C Có thể chia các phương pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn: - Nhóm các phương pháp phân tích hóa học - Nhóm các phương pháp phân tích công cụ 1.2.1. Phƣơng pháp phân tích hóa học Trong các phương pháp phân tích hoá học, phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử được sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hóa thành axit đehiđroascobic của axit ascobic. Để oxi hóa người ta sử dụng các thuốc thử khác nhau như: 2,6-điclophenolindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling... 2,6-điclophenolindophenol được coi như là thuốc thử chuẩn dùng để chuẩn độ xác định Vit.C một cách trực tiếp. Nó là một chất oxi hóa có màu xanh đậm, có công thức phân tử là C12H6Cl2NO2, max trong dung dịch nước = 602 nm. Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không màu. C6H8O6 - 2H+ - 2e- C6H6O6 C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e- C12H9Cl2NO2 Người ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo điện thế. Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic trong môi trường có PH thích hợp. Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên. Phương pháp này có thể được áp dụng trực tiếp để xác định Vit.C trong dược phẩm. Tuy nhiên trong các đối tượng khác như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ. 11 SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp Người ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp, xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lượng dư dung dịch KBr vào dung dịch mẫu đã được axit hóa bằng dung dịch H2SO4 1:1. Hỗn hợp này được chuẩn độ bằng dung dịch KBrO3 cho đến khi xuất hiện màu vàng của Br2 dư. Thực chất đã xảy ra phản ứng: 5Br- + BrO3- + 6H+ C6H8O6 + Br2 3Br2 + 3H2O C6H6O6 + 2Br- + 2H+ Khi hết axit ascobic lượng BrO3- cho vào, sẽ sinh ra Br2 không được phản ứng tiếp. Sau đó lại xác định lượng Br2 dư đó bằng phương pháp chuẩn độ iot bằng dung dịch natri thiosunphat chuẩn. Tuy nhiên các phương pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao. Vì vậy từ khi các phương pháp phân tích công cụ ra đời, người ta đã khắc phục được rất nhiều nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học. 1.2.2. Nhóm các phƣơng pháp phân tích công cụ Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển như vũ bão trong tất cả các lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh, chích xác, quy trình đơn giản, lượng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội. Với sự hỗ trợ của các phương pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng đã đạt được những yêu cầu đó. Đặc biệt, quy trình phân tích nhanh và đa số trường hợp không phải xử lý mẫu trước đã giảm thiểu được sự mất mát Vit.C trong quá trình định lượng. 12 SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp Các phương pháp công cụ có thể xác định Vit.C gồm các phương pháp phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích điện hóa. Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián tiếp. Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy người ta thường dùng một tính chất nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến đổi tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C. Hay khi dùng phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS. Người ta dùng một ion kim loại mang tính oxi hóa (ví dụ Fe III) để tác dụng với Vit.C theo tỷ lệ xác định. Việc xác định hàm lượng kim loại đó trên máy AAS là dễ dàng, từ đó có thể tính ra hàm lượng Vit.C ban đầu. Nhóm các phương pháp điện hóa, trong đó xác định Vit.C bằng phương pháp cực phổ, sử dụng điện cực giọt thủy ngân, là trực tiếp dựa trên tính chất oxi hóa khử của Vit.C. Ngoài điện cực giọt Hg, người ta còn dùng các điện cực biến tính, bằng cách tạo một lớp màng có hoạt tính điện hóa với Vit.C trên bề mặt điện cực rắn. Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp phân tích. Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA). 1.2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích quang học Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản ứng phát quang. Thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C. 13 SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp Các tác giả sử dụng các chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián tiếp xác định hàm lượng Vit.C. Kali cromat được sử dụng làm chất oxi hóa axit ascobic, kali cromat còn dư sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC) có mặt axit nitric tạo phức màu có max = 548 nm. Mật độ quang A đo ở max = 548 nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng kali cromat dư, và tỷ lệ nghịch với lượng Vit.C trong mẫu. 2CrO42- + 3C6H8O6 + 10H+ CrO42- + sym-DPC Cr3+ + 3C6H6O6 + 8H2O Cr-DPC phức ( max = 548 nm) Cr (III) tạo ra trong phản ứng thứ nhất là rất nhỏ nên không đóng góp đáng kể vào mật độ quang A đo ở max = 548 nm. Ưu điểm của phương pháp là sử dụng hóa chất đơn giản, dễ kiếm, máy đo quang không đắt tiền, phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Hơn nữa, theo nghiên cứu thì các chất khác có mặt trong đối tượng nghiên cứu cùng với Vit.C: các hợp chất glucozơ, fructozơ, sucrozơ, lactozơ, saccarozơ; các axit thường xuất hiện trong trái cây như axit xitric, axit oxalic, axit malic, axit tactric; các muối natri clorua, canxi clorua; các chất có thể xuất hiện trong thuốc tổng hợp như axit benzoic, axit salixilic, axetaminophen,... không gây ảnh hưởng đến kết quả đo ở mức sai số  5% khi hàm lượng của chúng gấp 200 lần lượng axit ascobic. Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được đường chuẩn tuyến tính đến hàm lượng Vit.C đến 5µg/mL (tương ứng 5ppm, khoảng 3.10-5 mol/L), và giới hạn phát hiện tới 0,02µg/mL (20ppm, khoảng 10-7 mol/L). Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt. 14 SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp Chen, Xu-wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detectơ đo quang. Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất oxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh ra tạo phức màu với 2,2’-đipiridin trong môi trường axit yếu (PH=5), kết quả đo A ở max = 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng axit ascobic trong mẫu. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu thuốc/giờ. Trong khi đó, Yebra-Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm lượng Mn(VII) còn dư, Mn(II) tạo ra sẽ được giữ trên lớp nhựa poly (axit aminophotphoric) sẽ không gây ảnh hưởng đến kết quả xác định Mn(VII) dư. Theo báo cáo cho biết thì giới hạn phát hiện chỉ khoảng 0,06 µg/mL (khoảng 60ppm, 3,5.10-4mol/L), tuy nhiên điều này không quan trọng lắm, vì hàm lượng Vit.C trong mẫu phân tích thường lớn. Nhưng quy trình phân tích này cho phép xác định tự động 90 mẫu/h, có khả năng ứng dụng trong các phòng phân tích của các nhà máy. Việc tăng độ nhạy xác định Vit.C đạt được khi sử dụng các phản ứng quang hóa mà axit ascobic có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển mức năng lượng. Dựa trên phản ứng quang hóa của Rodamin B và Ceri(IV) trong môi trường axit sunfuric, quy trình cho phép xác định Vit.C tới 10 -13 mol/L, đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 3,8.10-13 đến 10-10 mol/L. Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lượng Vit.C bằng phương pháp phân tích quang học rất phong phú và đa dạng. Tuy nhiên không tránh khỏi một phần Vit.C có thể phản ứng với oxi không khí hay các chất khử khác cũng có thể phản ứng với các chất oxi hóa đó. 15 SVTH: Lê Thị Thu Huyền Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2.2. Các phƣơng pháp phân tích điện hóa 1.2.2.2.1. Sơ lƣợc về phƣơng pháp von-ampe • Nguyên tắc của phương pháp Phương pháp von-ampe (phương pháp phân tích cực phổ) là phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa. Phương pháp này dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc và ghi đường von-ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng Faraday vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh). • Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampe SP: nguồn điện SW: cầu chia thế W: điện cực làm việc R: điện cực so sánh A: điện cực phù trợ V: vôn kế i: điện kế 16