Nghiên cứu đặc điểm sinh học, hoá học và khả năng ứng dụng của loài sưa ( dalbergia tonkinensis prain) ở một số tỉnh đông bắc việt nam

4 kháng viêm, chống dị ứng. Một số hợp chất khác lại có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, chống lại quá trình tụ tập tiểu cầu, diệt ký sinh trùng sốt rét và một số cầu trùng[7,11]. Bốn hợp chất flavonoid mới cùng với 13 hợp chất đã biết, được tách chiết từ lõi gỗ của loài Dalbergia louvelii có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum (Naima Beldjoudi et al., 2003). Rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như dalbergion, dalbergichinol, các reoflavanoid, triterpenoid glycosid... đã được tách chiết từ các loài thuộc chi Trắc. Hiện nay trên thế giới có khá nhiều các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Dalbergia. Đã có tới gần 300 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ chi này. Thành phần hóa học chủ yếu của chi Dalbergia là các hợp chất phenol, flanonoit, flavan, arylbenzofuran…Dưới đây là một số kết quả nghiên cứu tiêu biểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi này. Năm 1997, 25 hợp chất phenol và flavonoit được phân lập và xác định cấu trúc từ lõi gỗ loài Dalbergia odorifera. Trong đó hai hợp chất 4methoxydlbergione và cearoin thể hiện hoạt tính kháng viêm và chống dị ứng mạnh[7]. Đến năm 2006, bốn hợp chất phenol là 2''-O-methyl-isoliquiritigenin , odoriflavene, 5''-methoxy-vestitol và formononetin, tiếp tục được phân lập từ loài D. odorifera. Các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh. Ngoài ra, chúng còn ức chế sự giảm glutathione ở thủy tinh thể chuột khi kích thích bằng tia UV, hoạt tính này tương đương với -tocopherol[10]. Các nghiên cứu về loài D. cochinchinensis cũng thu được một số kết quả rất đáng quan tâm. Năm 1997, bốn hợp chất mới là 9-hydroxy-6,7dimethoxydalbergiquinol, 6-hydroxy-2,7-dimethoxy-neoflavene, 6,4''dihydroxy-7-methoxyflavan và 2,2''-5-trihydroxy-4-methoxybenzophenone, 5 được phân lập từ thân loài này. Năm 2003, năm hợp chất isoflavonoit được phân lập và xác định cấu trúc từ loài D. oliveri, trong đó có 2 chất mới là olibergin A và B. Chỉ có một số nghiên cứu về sinh học, sinh thái của cây Sưa ở Trung Quốc, còn những nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa trên thế giới hầu như chưa được đề cập đến. 1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Cho đến nay, chưa có bất kỳ tài liệu nào ở nước ta ghi nhận về tác dụng làm thuốc của loài Sưa, cũng như các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học của loài này. 6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thuộc chi Trắc (Dalbergia L. f.) của Họ Đậu (Fabaceae Lindl). 2.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại các địa điểm: Một số tỉnh phía Bắc,Tuyên Quang (Na Hang), Thái Nguyên (Đồng Hỷ), Hà Giang (Bắc Mê, Vị Xuyên, Quảng Bạ), Quảng Ninh (Vân Đồn, Minh Châu, Quan Lạng). Nghệ An (Nghĩa Đàn)… trại Cổ Nhuế. 2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 12/ 2010-3/2012. 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Nghiên cứu về sinh học - Điều tra khảo sát sự phân bố, một số đặc điểm sinh học sinh thái của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) theo tuyến, thu mẫu tiêu bản, mẫu phân tích hoá và thử hoạt tính sinh học. - Nghiên cứu khả năng nhân giống và khả năng sinh trưởng của loài Sưa theo các phương pháp nghiên cứu thông dụng về nông lâm học. - Điều tra thu thập tri thức bản địa trong nhân dân theo thep phương pháp PRA về việc khai thác và sử dụng loài Sưa tại một số nơi trong khu vực nghiên cứu. 2.4.2 Nghiên cứu về hóa học  Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 7 1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. 2. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. 3. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).  Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 1. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. 2. Phổ khối lượng (ESI-MS) Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1200 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 8 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học  Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định  Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus. - Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum. - Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.  Kháng sinh kiểm định - Ampicilin đối với vi khuẩn Gr(+). - Tetracylin đối với vi khuẩn Gr(-). - Nystatin đối với nấm sợi và nấm men. - Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong dung môi DMSO100% với nồng độ: Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM.  Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB) cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB). - Môi trường thí nghiệm: Eugon broth cho vi khuẩn, Myco phil cho nấm.  Phương pháp tiến hành và đọc kết quả - Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck 9 (1991) hiện đang được áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.  Thử hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)  Nguyên liệu - Dòng tế bào: Dòng KB (Human epidemoid carcinoma - ung thư biểu mô) từ phòng thí nghiệm Bioassay trường Đại học Dược Illinois- USA. Dòng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung thư màng tử cung). Dòng RD (Rhabdosarcoma-Ung thư màng tim) từ Viện VSDT Trung ương. - Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin-Streptomycin sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum). - Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic Acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic. - Các typ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tip cho micropipet… - Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Elipticine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0.01mM. - Tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu- 840C, tủ lạnh thường, máy li tâm, máy đọc Elisa; Box Laminar PII, bình ni tơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH, buồng đếm tế bào, kính hiển vi soi ngược.  Phương pháp tiến hành