Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của màng bacterial cellulose từ chủng acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Khả năng thấm hút của màng BC từ chủng A. xylinum BHN2 3.1.1. Khả năng thấm hút nước 3.1.2. Khả năng thấm hút kháng sinh 3.1.3. Khả năng thấm hút nghệ 3.2. Khả năng ngăn cản một số vi sinh vật 3.2.1. Khả năng ngăn cản vi khuẩn 3.2.2. Khả năng ngăn cản xạ khuẩn 3.3. Độ bền cơ học của màng BC 3.3.1. Theo chiều ngang 3.3.2. Theo chiều dọc 3.4. Độ thấu khí của màng BC 3.5. Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng màng 3.5.1. Màu sắc 3.5.2. Mùi vị 3.5.3. Độ pH 4. Ý nghĩa của đề tài - Đề xuất phương pháp xử lý ban đầu màng BC. - Nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC, tạo cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo ứng dụng trị bỏng trên thỏ. Phí Văn Tá 4 K33B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi khuẩn acetic) Trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm thực tiễn của mình xong chưa hiểu rõ cơ sở khoa học của quá trình tạo giấm, càng không thể giải thích được vì sao rượu loãng lại có thể chuyển thành giấm. Chỉ đến khi khoa học phát triển, đặc biệt cùng với sự ra đời của kính hiển vi, cùng với sự phát triển như vũ bão của công nghệ sinh học với trung tâm là vi sinh vật học thì vấn đề này ngày càng được sáng tỏ. Ngày nay, chúng ta khẳng định rằng tác nhân của quá trình tạo giấm chính là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn acetic. Công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn acetic là của Preson (1822). Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh đó là loài vi sinh vật có tên gọi Mycoderma aceti. Năm 1937, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận: Quá trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng năm đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen trong công trình nghiên cứu đã tách từ màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết, ông gọi nó là: Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum. Từ 1862 đến 1868, nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi, Pasteur đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen hoàn toàn đúng đắn. Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định: màng đó được tạo từ vi khuẩn Mycoderma aceti. Các nghiên cứu tiếp theo đều nhằm hoàn thiện, làm rõ cơ chế của quá trình lên men giấm và từng bước phân loại vi khuẩn thành các nhóm, loài khác nhau dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hóa và các ứng dụng của chúng. Phí Văn Tá 5 K33B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh Hiện nay, ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng Acetobacter trong sản xuất thạch dừa, sản xuất màng BC ứng dụng trong cuộc sống đặc biệt là trong trị bỏng, chất bán dẫn, vật hấp thụ chất độc môi trường… đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và hứa hẹn nhiều triển vọng trong tương lai [9], [18]. 1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter Để phân loại Acetobacter, người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau: - Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống. - Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xắp xếp tế bào, màu sắc tế bào khi nhuộm Gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy… - Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ giữa các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với ôxy, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ… - Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc… của khuẩn lạc trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không…) 1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter Việc nghiên cứu Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đi sâu nghiên cứu tìm hiểu. Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobater được tiến hành từ thế kỷ XIX. Trong đó có một số khóa phân loại đáng chú ý sau: Khóa phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck. Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu: Phí Văn Tá 6 K33B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh + Một là: sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh trưởng và phát triển. + Hai là: không hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển. - Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm 4 nhóm sau: + Nhóm 1: Vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với chúng. + Nhóm 2: Vi khuẩn sinh trưởng trên bia. + Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trên dịch rượu vang. + Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. - Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn acetic có tên gọi là Acetobacter [11]. - Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae. - Năm 1948, Vanghn tiến hành nghiên cứu khả năng di động của một số loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseumodonadaceae. - Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseumodonadaceae. - Theo khóa phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi khuẩn Acetobacter và Glucobacter – các vi khuẩn acetic được xếp vào họ Acetobacteriaceae. Phí Văn Tá 7 K33B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh - Năm 1914, dựa vào khả năng ôxy hóa acid acetic, Bergey phân chia các loài trong Acetobacter thành 2 nhóm: + Nhóm 1: có khả năng ôxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O. Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi trường Hoyer) như: Acetobacter aceti. Không sử dụng muối amoni là nguồn nitơ duy nhất. Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus. Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter xylinum. + Nhóm 2: không có khả năng ôxy hóa acid acetic. + Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt (Acetobacter melanogenus); sắc tố trắng hồng (Acetobacter recens). + Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp khoảng 30-35oC (Acetobacter sobuxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18-21oC (Acetobacter oxydans). Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khóa phân loại mới dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể: - Khả năng tạo catalaze. - Khả năng tổng hợp các chất xetô từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol, sorbitol. - Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O. - Khả năng oxy hóa glucose thành gluconic. - Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu etylic làm nguồn cacbon (sinh trưởng trên môi trường Hoyer ) Phí Văn Tá 8 K33B – SP Sinh Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi Sinh - Tạo sắc tố nâu. - Tổng hợp cellulose. Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau: Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950) Stt Tên nhóm 1 Suboxydans Vi khuẩn đại diện Acetobacter suboxydans. Acetobacter melanogennum Acetobacter aceti 2 Meroxydans Acetobacter xylium Acetobacter meroxydan 3 Oxydans Đặc điểm cơ bản Không có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O. Có đầy đủ các đặc điểm trên Acetobacter ascendans Không có khả năng tạo Acetobacter ransens các hợp chất xeto từ rượu Acetobacter lovaniens bậc cao Không có hoạt tính 4 Peroxydans Acetobacter peroxydans catalase, không oxy hóa Acetobacter paradoxum glucose thành acid gluconic 1.3. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter quan trọng. 1.3.1. Acetobacter aceti (Frateur 1864; Beijerinck 1898) Trực khuẩn ngắn, dạng hình que, kích thước 0,4 – 0,8 µm x 1,0 – 1,2 µm, không di động, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, bắt màu vàng với thuốc nhuộm iốt. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên môi trường gelatin. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 34oC, nếu nhiệt độ cao quá 43oC thì sẽ gây Phí Văn Tá 9 K33B – SP Sinh